解决方案人表皮生长因子受体2（HER2）是酪氨酸激酶的跨膜受体，是表皮生长因子受体（EGFR）家族的一员，具有酪氨酸激酶活性，在组织发育中起至关重要的作用，是胚胎发育所必需的。在正常成年人机体组织中，HER2通常低表达或不表达。但是，HER2的过表达往往会引起正常生物学功能的紊乱。许多研究表明，HER2的表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌等。因此以HER2为靶点的肿瘤靶向治疗一直是研究的热点。
2022年7月一篇发表在Researchgate网站上的名为“Designing a Humanized Immunotoxin Based on HER2 Specific scFv and DFF40 Toxin Against Breast Cancer: An In-Silico Study”的文章，提出以分子模拟技术来进行基于HER2特异性scFv和DFF40毒素设计抗乳腺癌人源化免疫毒素的研究。
曲妥珠单抗是一种能与HER2受体结合的抗体，其衍生的单链抗体(scFv)可用于设计靶向HER2阳性癌细胞的免疫毒素。DFF40是一种由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活的核酸酶，负责细胞凋亡过程中的基因组DNA片段化。在该研究中，研究人员利用生物信息学工具设计了含有HER2特异性scFv和DFF40毒素的免疫毒素。将scFv和DFF40的氨基酸序列通过肽链连接，构建免疫毒素。然后对该结构的二级结构、理化特性、溶解度和致敏性进行了预测，并进行三维结构的建立、改进和评估，最后分别进行蛋白-蛋白对接和分子动力学研究，评价免疫毒素与受体的结合和免疫毒素的稳定性。结果表明，所设计的蛋白是一种溶解度适宜的稳定蛋白，不具有过敏原性质，具有与HER2结合的合适结构。最后，该构建体有望成为制备靶向HER2免疫毒素的候选材料。然而，需要进行不同的体外和体内免疫学试验来确认所设计的结构的效果。
实验方法
将曲妥珠单抗(赫赛汀)单链抗体(scFv)与DFF40毒素偶联，构建融合蛋白曲妥珠单抗-DFF40。从UniProtKB (http://www.uniprot.org/)中获得融合蛋白的氨基酸序列。(G4S)3是一种柔性肽连接体，用于将赫赛汀的VL和VH与DFF40结合(图1)。
首先根据一级氨基酸序列对曲妥珠单抗-DFF40融合蛋白的二级结构进行预测。首先分别分析VL和VH的二级结构，然后评估scFv及其连接子的结构。
蛋白质的物理化学性质对其稳定性和溶解度有实质性的影响。因此，作者首先计算研究了曲妥珠单抗-DFF40融合蛋白的理论等电点(pI)、分子量(MW)、总电荷、不稳定指数、脂肪指数和总平均亲水性等理化特性。使用AI预测结构的溶解度。
首先通过建模构建曲妥珠单抗-DFF40融合蛋白的三维结构并进行优化，优化方法包括侧链重建和修复。最后评价三维结构的质量。
通过基于非序列描述符的指纹识别方法评估该蛋白的过敏原性。
根据能量最小化预测设计的免疫毒素的单链RNA或DNA序列的二级结构。
利用蛋白蛋白对接软件预测从PDB数据库获得的HER2 (PDB ID: 5WJL)受体与设计的免疫毒素之间的受体-配体相互作用模式。
通过MD模拟研究，选择相互作用最强的HER2免疫毒素模型评估其稳定性和结构变化。分子动力学的模拟使用GROMACS 2018包和OPLS-AA力场在一个10Å立方的模拟盒中进行，采用SPC作为水模型。然后，系统的电荷被Na+和Cl-离子中和。采用最陡下降法最小化对接模型的能量，通过5000步最小化，Fmax小于100 kJ/mol/nm。此外，对模拟系统进行了100ps NVT(粒子数、体积和温度恒定)和NPT(粒子数、压力和温度恒定)的平衡。使用线性约束求解器(LINCS)算法对所有约束进行组织。采用半径为1.0 nm、网格间距为0.16 nm的PME算法计算静电相互作用。最后，对于HER2 -免疫毒素复合物，在平衡系统上用两个fs时间步长进行了100 ns的模拟过程。评价HER2 -免疫毒素复合物的稳定性、计算溶剂可及表面积(SASA)、均方根偏差(RMSD)、氢键(H-bonds)、均方根波动(RMSF)和旋转半径(Rg)。
实验结果
从PDB和Uniprot数据库中检索曲妥珠单抗scFv和DFF40蛋白的氨基酸序列。选择GGGGSGGGGSGGGGS氨基酸序列作为VL和VH之间的连接物，用于形成赫赛汀。该柔性连接子也被选为连接抗体与毒素的最佳连接子。
预测scFv和曲妥珠单抗 (scFv-DFF40蛋白)的二级结构。结果表明，在scFv中加入DFF40并形成嵌合蛋白，并不改变该片段的二级结构。二级结构由20.37%的α-螺旋、22.39%的延伸链和57.24%的无规卷曲构成。
图2：设计的免疫毒素的二级结构。c:无规螺旋，e:延伸股，h: α螺旋
